植物病原菌的分離培養(yǎng)是植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)**基本的操作技術(shù)之一，它對(duì)原害鑒定，病原形態(tài)觀察、植物病害接種體的培養(yǎng)等方面都是經(jīng)常使用的研究手段。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，要求植物病原菌分離培養(yǎng)的一般原則和方法。

三、實(shí)驗(yàn)材料及準(zhǔn)備

1.分離材料：梨黑斑病（Alternaria kikuchiana），柿樹(shù)圓斑?。≒estnlotia sp）及杉木炭疽病（Glomerella cingolata）新發(fā)病的病葉；楊樹(shù)爛皮病（Cytospora chrysosperma）G槐腐爛?。―othiorella sp.）的帶有新病斑的枝條；油松種子。

2.分離用具：酒精燈4個(gè)，手術(shù)剪4把，眼科鑷4把，PDA培養(yǎng)基3瓶，培養(yǎng)皿（Φ9cm）24套，小燒杯（5ml）4個(gè)，大燒杯1個(gè)，斜面培養(yǎng)基12管，滅菌水4瓶，75%酒精瓶1個(gè)（內(nèi)放脫脂棉球）0.1%升汞瓶1個(gè)，5%乳酸瓶（60ml）1個(gè)，火柴1盒，濕、干紗布各4張。

四、實(shí)驗(yàn)方法及步驟

（一）分離前的準(zhǔn)備工作：

1.工作環(huán)境的清潔和消毒

分離培養(yǎng)一般在無(wú)菌室、無(wú)菌箱或無(wú)菌工作臺(tái)（超凈工作臺(tái)）上進(jìn)行，無(wú)菌室和無(wú)菌箱要經(jīng)過(guò)噴霧除塵，并用藥物或紫外線(xiàn)照射消毒（常用消毒藥物為70%酒精，2%煤酚皂液，5%石炭酸液等噴霧。若用紫外線(xiàn)燈照射則需20-30分鐘）。在沒(méi)有上述設(shè)備條件時(shí)，在清潔房間里關(guān)閉門(mén)窗，避免空氣流動(dòng)，經(jīng)過(guò)噴霧除去空氣及地面灰塵后進(jìn)行操作，也可獲得較好的結(jié)果。工作前擦凈桌面，**好鋪上濕紗布。將所需用的物品按次序放在工作臺(tái)上，避免工作時(shí)走動(dòng)，工作人員**好穿上滅菌后的工作服，帶上口罩，并用肥皂洗手，用70%酒精或0.1%新潔爾滅擦手。

2.分離用具的消毒

凡是和分離材料接觸的器皿（刀、剪、鑷、針等）都要隨時(shí)（**少在使用時(shí)）保持無(wú)菌，將這些用具浸于70%酒精中，使用時(shí)在燈焰上滅菌燒去酒精，如此2-3次（刀、剪、鑷等不宜在燈焰上燒時(shí)過(guò)長(zhǎng)，以防退火）。再次使用時(shí)必須重復(fù)滅菌。培養(yǎng)皿、試驗(yàn)等要經(jīng)過(guò)干熱滅菌。培養(yǎng)基及洗滌或稀釋用蒸餾水都需要事先經(jīng)過(guò)高壓蒸氣滅菌。

3.分離材料的選擇

用新發(fā)病的植株、器官或組織做為分離材料，可以減少腐生菌的污染。任何植物壞死部分的內(nèi)部或表面，都可能有腐生微生物的孽生，所以一般斑點(diǎn)病害應(yīng)從鄰近健全組織，即從病、健組織交界處獲得分離材料。

（二）植物病原菌的分離

1.葉斑類(lèi)和枝桿病斑類(lèi)（非維管束侵染）病原菌分離

shou先選擇具有典型癥狀的新鮮病葉作為分離材料，按下述步驟操作：

①培養(yǎng)基平板制備：將PDA培養(yǎng)基在微波爐中加熱熔化驗(yàn)，以無(wú)菌操作法將溶化過(guò)的培養(yǎng)基傾注入滅過(guò)菌的培養(yǎng)基中，每皿經(jīng)12毫升，可形成2-3毫米厚的平板。（為防止細(xì)菌污染，倒碟前給每三角瓶?jī)?nèi)加6%乳酸4-6滴）。

②病葉或病枝經(jīng)自來(lái)水沖洗，從病斑周轉(zhuǎn)1-2毫米處的健組織部位剪下（若為枝干，則將帶有病斑的皮層剝下）。

③取10毫升小燒杯經(jīng)酒帶消毒，放入分離材料，倒入0.1%升汞液適量作表面消毒一分鐘，或用1%漂白粉消毒均可。

④消毒后傾出消毒液，用無(wú)菌水沖洗2-3次，**后一次無(wú)菌水不要倒掉。

⑤用滅菌鑷，剪在無(wú)菌水中將分離材料剪成2-3毫米大小的方塊，每塊組織均應(yīng)為病健相間組織。用滅菌鑷子夾取剪好的材料，放入培養(yǎng)基平板上，輕輕按壓。每皿4-5塊，排放均勻。

⑥用蠟筆在培養(yǎng)皿上注明分離代號(hào)，日期、姓名，將培養(yǎng)皿翻轉(zhuǎn)放置于23-25℃

⑦3-4日后挑選由分離材料上長(zhǎng)出的典型而無(wú)雜菌的菌落，在菌落邊緣用移菌針挑取帶有菌絲的培養(yǎng)基一小塊，轉(zhuǎn)入試管斜面培養(yǎng)基中央，于25℃溫箱中培養(yǎng)。

2.種子內(nèi)病菌的分離

將整粒種子或種子的一部分進(jìn)行沖洗，再經(jīng)表面消毒（升汞或漂白粉），**后用滅菌水洗滌后移到人工培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)（或者直接放在皿內(nèi)保濕培養(yǎng)于25℃溫箱中）。

3.有害輸導(dǎo)組織病原菌的分離（以枯萎病為代表）

先將分離莖作表面消毒，然后用滅菌刀剝?nèi)ケ砥?，剪取其中小塊變色的維管束組織，再用漂白粉進(jìn)行表現(xiàn)消毒后，移于培養(yǎng)基平面上培養(yǎng)。

（三）分離物的純化

前述方法獲得分離物，必須經(jīng)過(guò)純化，才能成為培養(yǎng)，純化的方法有單孢子分離法和邊續(xù)稀釋培養(yǎng)法兩種，后者簡(jiǎn)便，為了一般研究所常用。

連續(xù)稀釋法：對(duì)真菌材料來(lái)說(shuō)，就是從典型菌落邊緣切取含有菌絲的培養(yǎng)基一小塊，移植于另一培養(yǎng)基平板上，待菌落形成后，再依此法移植。如此數(shù)次，直**菌落形態(tài)典型，無(wú)雜菌時(shí)即可移入斜面試管中培養(yǎng)保存。

附：

1、0.1%升汞液的配制：升汞1克，濃鹽酸2.5毫升；加水1000毫升。注意要先將升汞用鹽酸溶解，然后加水稀釋。

2、P.D.A培養(yǎng)基成分；馬鈴薯200克，葡萄糖10-20克，洋菜17-20克，水1000毫升。

3、水洋菜培養(yǎng)基成分，洋菜17-20克，水1000毫升。